В нашей лаборатории для расшифровки олигонуклеотидных последовательностей ДНК и РНК в качестве базового используется метод пиросеквенирования. Пиросеквенирование – метод, основанный на принципе «секвенирование путем синтеза».
«Секвенирование путем синтеза» заключается в том, что с изучаемой одноцепопчной ДНК заново синтезируют комплементарную цепочку. В момент присоединения каждого нуклеотида регистрируется вспышка света. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются последовательно и элиминируются после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотида соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.
Схема процесса пиросеквенироавния
Шаг 1
Амплификация фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей для пиросеквенирования. Денатурация биотинилированного одноцепочечного ПЦР-ампликона, его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования.
Шаг 2
Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5’- фосфосульфата (APS) и люциферина.
Шаг 3
Добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК– полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к после- довательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопро- вождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимоляр- ном количеству встроившихся нуклеотидов.
Шаг 4
АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’- фосфосульфата. Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу.
Шаг 5
В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид.
Шаг 6
Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. Следует отметить, что дезоксиаденозин-альфа-тио-фосфат используется в роли заместителя дезоксиаденозин-3-фосфата (дАТФ), так как он эффективно распознается ДНК-полимеразой, но не распознается люциферазой. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на Пирограмме.
Хотя данный способ секвенирования является наиболее точным с точки зрения точности работы с индивидуальными образцами, в настоящий момент существуют некоторые ограничения в его применении. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300—500 нуклеотидов, что короче, чем 800—1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера). Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов.
Принципиальная схема пиросеквенирования и пример пирограммы – двойные пики означают последовательное включение двух нуклеотидов.
Хотя данный способ секвенирования является наиболее оптимальным с точки зрения точности работы с индивидуальными образцами, в настоящий момент существуют некоторые ограничения в его применении. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300—500 нуклеотидов, что короче, чем 800—1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера). Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов.
Однако, по сравлению с методом пиросеквенирования другие методы имеют ряд существенных недостатков.
Так, ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) в силу технологических особенностей ограничен по списку генов и полиморфизмов и по этой же причине невысока достоверность результатов для многих полиморфизмов, а также высока цена разработки и производства тест-систем.
Гибридизационный метод основана на гибридизации различных олигонуклеотидных зондов с целью восстановления последовательности ДНК- мишени. Существуют два подхода: первый заключается в иммобилизации ДНК-мишени; при втором — иммобилизуются олигонуклеотидные зонды. Секвенирование путем гибридизации применяется как для повторного, так и для de novo-секвенирования.
К основным недостаткам данной технологии относятся довольно короткая длина прочтения (∼25bp), что связано с ограниченной длиной зонда [7], трудоемкая подготовка образцов, возможность кросс-гибридизации зондов из-за повторяющихся элементов или их случайного сходства. Последний фактор может явиться причиной значительной потери генетической информации, например, свыше 50% хромосомы 21, анализ только больших комплексов генов (отсутствие возможности детекции отдельных полиморфизмов) и очень высокая стоимость оборудования для постановки анализа.
Метод рестрикционного анализа основан на разрезании геномной ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза.
К недостаткам этого метода можно отнести в первую очередь ограничение по списку генов и полиморфизмов
(по причине конечного числа сайтов рестрикции для эндонуклеаз, крайне низкая достоверность результатов
и значительное влияние человеческого фактора (высокая трудоемкость метода, большое количество ручного труда, отсутствие возможности автоматизации процесса).
Оборудование
Секвенаторы PyroMark Q96 ID и PyroMark Q24 производства Qiagen предназначены для анализа генетических или эпигенетических модификаций ДНКи РНК с использованием технологии пиросеквенирования.
Заранее введенная нуклеотидная для каждого генетического полиморфизма последовательность обеспечивает встроенный контроль качества анализа.
PyroMark Q96 включает широкий спектр анализов.
Позволяет проводить одновременный анализ как 96 различных полиморфизмов, так и 96 образцов на разные мутации.
Скорость – 192 полиморфизма в час.
Быстрое и недвусмысленное определение результатов секвенирования.
Точность генотипирования определяется вероятностью ошибки при пиросеквенировании – менее 1 на 10 000 нуклеотидов.
Благодаря заранее известным вариантам полиморфизмов реакция генотипирования может пройти либо по одному из известных протоколов, либо не пройти. В данном методе нет так называемой «серой зоны».
Рассмотрим конкретный пример.
На иллюстрации представлены расчётные схемы пирограмм для каждого из вариантов (обоих гомозиготных и гетерозиготного) анализируемого полиморфизма, а также реальная пирограмма проверяемого образца. Полученная пирограмма автоматически сверяется с расчётным стандартом, и компьютер выдает заключение о полученном генотипе пациента.
PyroMark Q96 ID является мощным инструментом для секвенирования и хорошо подходит для эпигенетики, анализа экспрессии генов, мутаций. С его 96-луночного формата, функцией автоматического основанием вызова и специализированных программных решений для анализа метилирования и дизайна , PyroMark Q96 ID может справиться с любой исследовательский вопрос, требующий истинную информацию о последовательности и количественное определение генетической или эпигенетической изменчивости.
